活細胞骨架染色：實時觀察3D細胞培養微環境與細胞遷移的互作用

2D細胞外基質（ECMs）的物理特性會影響到細胞的粘附動態和形態，但是3D細胞外基質的局部微環境對細胞的影響卻知之甚少。美國的科研人員構建了幾種3D膠原基質，研究其微結構的變化對于調節3D狀態下的細胞粘附動態和細胞遷移的影響。細胞外基質中有各種成束的纖維會加強局部可粘位點的堅固性，并且可以通過ECM/粘附偶聯點增強細胞的粘附穩定性，并且高度柔軟的網狀聯合促進了粘附的收縮力。3D粘附的動力學由局部的ECM的強度和整合素/ECM還有II型肌球蛋的收縮白共同調節。不同于2D遷移，3D的細胞遷移不僅受ECM孔徑大小影響。

科研人員需要觀察活細胞的在成束的纖維中細胞前沿的突出點的形態變化，和細胞運動的軌跡。使用LifeAct標記細胞的F-actin能夠不影響細胞功能和行為的情況下對細胞進行觀測。研究人員發現細胞會將細胞前進的邊緣沿著成束的纖維長邊移動。具有接觸導向的作用，這一點在纖維和細胞前進邊緣平行時尤為明顯。而纖維母細胞在不同的ECM中也顯示出了類似的特性，是將纖維拉向細胞自身的同時將偽足向前延伸，并遷移的。

Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions

Andrew D. Doyle，Nicole Carvajal, Albert Jin，Kazue Matsumoto& Kenneth M. Yamada

Nature Communications 6, Article number: 8720 doi:10.1038/ncomms

（一）實驗材料

• 細胞:     fibroblast            （gift from NIDCR/NIH）
• 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質粒    （ibidi， Germany）

             Phenol red-free DMEM      （Hyclone）

             FBS                        （Hyclone）

             L-glutamine           (GIbco)

             Anti-collagen I         ( Millipore,1:200, Cat# ABT-123)

• 儀器：   電轉儀                 (Bio-Rad Gene Pulsar TM)

（二）實驗步驟

  1、LifeAct-GFP轉染

 使用0.4cm的電擊杯，設定電壓為170V, 960uFd，持續時間17-22μs。

  2、collagen I 預染

• 5ml 的3mg/ml的collagen1在室溫固化
• 之后，膠置于50mM的硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）中孵育10min
• 室溫避光條件下使用灌流管逐漸用含有NHS脂染料的硼酸鹽溶液逐漸替換之前的緩沖液并孵育1小時。
• 保持染料一直處于灌流的狀態，并且在孵育用TRIS溶液沖洗10分鐘，并用PBS沖洗數小時移除沒有結合的染料
• 使用200mM的鹽酸溶解已凝固的膠知道所有的膠溶解
• 以1:1000的比例用20nM的冰醋酸透析上述膠溶液4小時
• 實驗前，用標記過的collagen I替換2-4%的未標記的collagenI，并和細胞混勻，開始試驗。

• 實驗結果

如圖所示：表達EGFP-LifeAct的fibroblast（綠色或灰色）在FB4 ECM（紅色）中的活細胞成像實驗。從時間序列的拍攝結果可以看出，細胞一直是沿著纖維的方向，將actin富集到細胞的絲狀偽足（白箭頭）中，控制細胞的遷移方向。星號代表了一條膠原纖維起止位置，青色的線作為其位置的參照物表明，細胞是通過將纖維拉向自己的方式來向前移動的。