全內反射熒光顯微實驗TIRF實驗

整合素是一種跨膜蛋白，在介導細胞黏附到細胞外基質（ECM）過程中發揮重要的作用。整合素在和配位體結合并發揮作用之前需要被激活。Kindlin和talin如何在非造血細胞中介入激活整合素這一過程的原理并不十分清晰。美國的科研人員發現缺少成纖維細胞，talin或kindlin都不能激活β1整合素，從而不能粘附到纖維粘聯蛋白表面上；甚至不能由Mn2+介導的整合素粘連構象發生轉變。使用Mn2+可以激活talin而不是kindlin缺陷細胞的部分整合素功能，使其活化和粘附在纖維粘連蛋白表面上。而具有方向性的粘附實際是由Kindlin直接誘導結合樁蛋白，可以反過來會粘附斑激酶（FAK）導致FAK活化并形成片狀偽足。這一研究結果表明，talin和Kindlin協同激活整合素與纖維粘連蛋白的結合，并隨后Kindlin會獨自形成一個特別的信號位點，形成新的蛋白粘附位點。

本實驗中，采用talin和kindlin正常細胞核缺陷細胞作為樣本，對比各種細胞中整合素的分布，并且觀測加入Mn2+后，細胞行為的變化著整合素的分布。不僅采用了免疫熒光的方法進行整合素的定位，并且在同一樣本中使用TIRF技術，準確定位整合素的表達。

Elife. 2016 Jan 27;5:e10130. doi: 10.7554/eLife.10130.

Kindlin-2 cooperates with talin to activate integrins and induces cell spreading by directly binding paxillin.

Theodosiou M1, Widmaier M1, Böttcher RT1, Rognoni E1, Veelders M1, Bharadwaj M2, Lambacher A1, Austen K1, Müller DJ2, Zent R3,4, Fässler R1.

一、實驗材料

1）細胞： Kind^ctr Cell （Kindlin正常對照細胞）

          Tln^ctr Cell  （talin正常對照細胞）

          Kind^ko Cell   (Kindlin缺陷細胞)

          Tln^ko Cell    (talin缺陷細胞)    

2）試劑： fibronectin（20 μg/ml, Calbiochem）

          4%多聚甲醛PBS溶液

          0.1% Triton X-100

          3%BSA

3）培養耗材：µ-Slide 8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理 （ibidi，Germany，80826）

二、實驗方法

一）載玻片包被

①　每孔加入300μl 的  20 μg/ml的fibronectin溶液

②　室溫孵育60分鐘

③　吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用

二）免疫熒光實驗

1）鋪細胞，每孔鋪約100000個細胞

2）加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，靜置15分鐘

3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

5）依次加入一抗，二抗進行免疫熒光染色后，沖洗小室并加入封片液進行顯微鏡觀察（圖二）。

圖二：圖示鋪細胞，固定，清洗，染色步驟。

三、實驗結果

圖三：整合素在talin和kindlin缺陷細胞中的分布。A）共聚焦成像，顯示細胞腹部的β1整合素（綠色）和F-actin（紅色）在細胞中的分布。對比了有Mn²⁺存在或缺失的情況。B）共聚焦成像，顯示細胞腹部的9EG7定位結果。C）TIRF成像，顯示出β1整合素和柱蛋白的定位。D）TIRF-dSTORM采集的熱圖，顯示出局部整合素的密度。