此次實驗便是應(yīng)用了ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上分析MCF-7細胞遷移實驗的詳細方案，為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，并進行測試了五種不同濃度的人表皮生長因子（hEGF）對遷移行為的影響并與對照條件進行比較。

　　實驗工作流程：

　　3.1 步驟1：細胞接種　　

　　正確的接種濃度是一個關(guān)鍵參數(shù)，因為24小時后應(yīng)達到匯合的單層。需要進行預(yù)實驗以確定所用細胞系的最佳濃度。

　　1. 取下附在μ-Plate底部的保護膜?！?/p>

　　2. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將MCF-7細胞懸浮液調(diào)節(jié)至細胞濃度為5×105細胞/ml?！　?/p>

　　3. 將70μl細胞懸浮液應(yīng)用于2孔的培養(yǎng)插件每個孔中。避免搖動μ-Plate，因為這會導(dǎo)致細胞分布不均勻?！　?/p>

　　4. 將細胞在37°C和5％CO2培養(yǎng)至少24小時?！　?/p>

　　圖2在開始細胞接種步驟（A）之前取下保護膜。將70μl細胞懸浮液填充到2孔培養(yǎng)插件（B）的每個孔中。

　　3.1 步驟2：劃痕形成

　　μ-Plate 24 Well的使用并行測試五種不同的hEGF濃度和對照條件。每種實驗條件可以進行四次技術(shù)重復(fù).　

　　1. 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)24小時后的細胞密度。如果24小時后未達到融合細胞單層，則將μ-Plate于細胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)幾個小時。定期檢查匯合點?！　?/p>

　　2. 將生長因子添加到細胞培養(yǎng)基中以獲得以下濃度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF。　　

　　3. 用無菌鑷子輕輕取出2孔培養(yǎng)插件。要移除培養(yǎng)插件，請抓住一個角，如圖3所示?！　?/p>

　　4. 用無細胞培養(yǎng)基或PBS洗滌細胞層以除去細胞碎片和未附著的細胞?！　?/p>

　　5. 小心吸出無細胞培養(yǎng)基或PBS?！?/p>

　　6.用移液管將1ml細胞培養(yǎng)基加到24孔板的每個孔中。

　　圖3使用無菌鑷子取出2孔培養(yǎng)插件

　　3.1 步驟3：獲取顯微鏡圖像　　

　　我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征?！　?/p>

　　1. 將μ-Plate 24孔培養(yǎng)板放在顯微鏡上并確定所有24個孔的位置?！　?/p>

　　2. 在接下來的幾個小時內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。在24小時內(nèi)每30分鐘拍攝一次圖像?！　?/p>

　　4.結(jié)果　

　　分析顯微圖像以獲得關(guān)于培養(yǎng)細胞遷移特征信息。分析細胞覆蓋區(qū)域隨時間的變化來確定細胞速度。

　　圖4 hEGF對MCF-7細胞遷移行為影響的比較。測試了四種不同的EGF濃度，并與對照實驗進行了比較。

　　使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上進行測試六種不同（或更多）的條件。通過比較細胞速度與對照條件的速度來分析五種不同hEGF濃度（每種重復(fù)四次）的影響。實驗數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，hEGF增加了MCF-7細胞的細胞速度。如圖4所示，hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細胞速度沒有進一步增加。