ibidi|腫瘤學血管生成實驗的操作過程

　　此次實驗是以HUVEC細胞為例，來介紹腫瘤學血管生成實驗的操作過程這一實驗的詳細過程。

圖一  血管生成鏡檢圖

　　實驗步驟：

　　1、準備基質膠　　

　　1）實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4℃預冷的槍頭用于吸取Matrigel）　　

　　2）開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。　　

　　3）打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。　　

　　4）每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。

　　由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會影響到實驗的成像結果。

　　如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：　　

　　我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。

　　如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態。

　　2  凝膠　

　　1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。　　

　　2）準備一個10cm的培養皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。　　

　　3）將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。　　

　　4）將整個培養皿放入培養箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結。　　

　　5）等待同時準備細胞懸液。

　　3  鋪細胞　

　　加入細胞的量直接影響實驗結果，所以在正式實驗開始之前，要對不同類型的細胞和使用數量進行預實驗。獲得最佳比例的細胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細胞，每孔種10000個細胞即可。　　

　　1）準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。　　

　　2）將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。　　

　　3）每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。　　

　　4）同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養基，使上孔液體正好加滿。　　

　　5）蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

　　4  采集圖像并統計結果　　

　　可以按照細胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度，覆蓋面積，成環數，結點數進行測量和記錄，并且對其進行統計分析。

　　5  免疫熒光染色　　

　　根據需要，可以對成管結果進行免疫熒光染色。　

　　1）小心的移除上孔內培養基，注意不要碰到膠或者細胞網絡。　　

　　2）加入50μl用無血清培養基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。　

　　3）在室溫下避光孵育30分鐘。　　

　　4）使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細胞。　　

　　5）使用 485 nm/ 529 nm進行免疫熒光成像。