免疫熒光實驗iPSC-derive神經元的體外神經毒性檢測

如今神經毒性檢測主要是依賴活體動物實驗，不僅有倫理問題，而且通常非常昂貴并且十分耗時。當需要大規模的測試化合物的時候就不太合適了。因此，高通量的體外的神經毒性測試就顯得十分必要了，而且可以使用人源的細胞直接進行試驗，試驗結果的實用性也更佳。但是，到目前為止，人源干細胞誘導的神經元并沒有適合進行這類試驗的特質，試驗時間較長，批次間差異大，并且有收到倫理和一些法律的制約，使得這種細胞都不太適用于做大規模的體外測試試驗。近，市面上出現了商用的人源iPSC-derive神經元細胞，重復性好，可以用來做這類的體外神經毒性試驗。

荷蘭的科學家使用人源iPSC-derive神經元細胞做了免疫熒光染色試驗，作為高通量進行體外的神經細胞毒性檢測的預試驗。由不同供應商提供的人源iPSC-derive神經元細胞混合培養能夠形成不同（激活型或抑制型）神經元共培養的樣本。

ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091

Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?

Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.

一、實驗材料

1）細胞： iCell^® Neurons （NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international）

          CDI iCell® Astrocytes（Cellular Dynamics international）

          HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)

          DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    

2）培養基：Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)

3）試劑： Poly-L-Ornithine （[PLO] 0.01%）

4）培養耗材：µ-Slide 8孔腔室載玻片，ibiTreat底部處理 （ibidi，Germany，80826）

二、實驗方法

一）載玻片包被

①　每孔加入300μl 的  0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液

②　室溫孵育60分鐘

③　吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘，即可開始使用

二）免疫熒光實驗

1）鋪細胞：

iCell^® Neurons 每孔鋪100000個細胞

iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培養，每孔鋪66000個細胞

HIP neurons 每孔鋪100000個細胞

DOPA.4U® neurons 每孔鋪52000個細胞

DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培養，每孔鋪48000個細胞

2）加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，靜置15分鐘

3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

5）依次加入一抗，二抗進行免疫熒光染色后，沖洗小室并加入封片液進行顯微鏡觀察（圖二）。

圖二：圖示鋪細胞，固定，清洗，染色步驟。

三、實驗結果

圖三：iPSC-derive神經元的免疫熒光染色結果。不同種類的人源iPSC-derive神經元使用β(III)tubulin（綠色）和GFAP（紅色），用來區分神經元和星型膠質細胞（HIP® neurons, 左上；DOPA.4U® neurons，左下；iCell neurons，右上。） Human iCell 神經元用vGAT (綠色) 和vGluT (紅色)確定抑制或激活突觸（右下）。細胞核使用DAPI染色（藍色）。