環形細胞侵襲實驗--使細胞侵襲的過程可視化

腫瘤細胞的侵襲能力是腫瘤轉移的一個重要特征。為了研究腫瘤細胞侵襲過程的機制，一系列體外細胞實驗建立起來，用于研究細胞侵襲基底膜和基質的過程。體外侵襲實驗首先是采用人工重構基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐漸凝固成膠，結構與天然基質膜結構極為相似。通常的實驗是在孔徑8μm的濾膜上鋪上一層Matrigel，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過。實驗之后通過對穿過“基質膜”的細胞進行計數，來確定細胞的侵襲能力。這一方法非常仿真的模擬了細胞在生物狀態下的侵襲過程，但是其也有一定的局限性。由于濾膜的不透光性，使得直接觀察細胞偽足和骨架變化變得非常困難。

英國的科研人員改進了腫瘤侵襲實驗，設計了一種環形細胞侵襲實驗，使得操作進一步簡化，并且也能模擬3D侵襲。重要的是，能夠使侵襲過程中的活細胞或者是固定的細胞可視化。借用這個實驗方法，研究人員發現侵襲過程中主要有蛋白酶參與其中。研究發現，在3D侵襲的細胞中蛋白酶會聚集在偽足和細胞的粘附點上。

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay

X. Yu and L. M. Machesky

PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605

（一）實驗材料

• 細胞:   MDA-MB-231
• 實驗耗材:  傷口愈合插件         （ibidi，80209）

               玻璃底培養皿      （ibidi，81158） 

• 試劑:    Matrigel           （BD）

             4%多聚甲醛溶液

             0.1%Triton X-100

（二）實驗步驟

• 將ibidi傷口愈合插件放入ibidi玻璃底培養皿中間
• 在插件外部鋪 6 × 10⁵ MDA-MB-231細胞，等待細胞貼壁
• 細胞貼壁后移除傷口愈合插件，在細胞形成一個0.8cm²的空白區域
• 加入250μl的50% BD Matrigel （4.5mg/ml），將培養皿內層剛好鋪滿，能形成一個0.8mm厚度的“基質膜”
• 孵育2小時，使Matrigel固化，加入培養基
• 在37^。C培養箱中孵育24小時。
• 以4%多聚甲醛溶液固定30分鐘，并以 0.1%Triton X-100通透30分鐘后可以加入DAPI或者抗體染色

• 實驗結果

1、使用環形細胞侵襲實驗能夠觀測到細胞侵襲中的活動（圖一）

圖一：MDA-MB-231細胞在環形細胞侵襲過程中形成了侵襲鏈：A）MDA-MB-231細胞在matrigel中形成了一個長的侵襲鏈 B）勤洗臉的免疫熒光圖，紅色為Actin，藍色為細胞核

2. 使用環形侵襲實驗能夠記錄對比侵襲速率和侵襲面積（圖二）

圖二：MDA-MB-231細胞侵襲過程受MMP調控。加入25μM的GM6001能顯著的減緩侵襲速率和侵襲面積。