細胞共培養--CD34前體干細胞對內皮細胞團的旁分泌影響

細胞共培養實驗是將2種或2種以上的細胞共同培養在同一環境中的實驗，更好的模擬體內細胞互相通信的生理情況。一般有兩種共培養方法：1）直接接觸共培養體系：是指直接將2種或2種以上的細胞按照一定比例混合，鋪在一個孔中；2）間接接觸共培養體系：是指將不同種類的細胞共用一種培養環境，而不互相接觸，查看細胞分泌因子對另外的細胞的影響。這里我們介紹的是采用間接接觸共培養的方法，研究CD34祖細胞的分泌物對由內皮細胞組成的細胞團在血管形成上的影響。

文中，研究人員將CD34祖細胞和內皮細胞團共培養后發現，CD34祖細胞使內皮細胞團血管生成的出芽長度增長了18%，如果在此基礎上將氧濃度從20%降低到1%，血管生成的出芽長度增長了52%。說明CD34細胞和低氧情況都會促進內皮細胞血管生成的發生。

Paracrine effects of CD34 progenitor cells on angiogenic endothelial sprouting

R. J. Scheubel, J. Holtz, I. Friedrich, J. Borgermann, S. Kahrstedt, A. Navarrete-Santos, R. E. Silber and A. Simm

International Journal of Cardiology, 2008, 10.1016/j.ijcard.2008.10.009

1. 實驗材料：

1. CD34細胞
2. HUVEC細胞團         1000個細胞/團
3. Collagen Gel
4. ECGM                內皮細胞生長培養基
5. 共培養載玻片（圖一）          德國ibidi公司，81806

圖一：ibidi共培養載玻片特點，可見載玻片上有2個大孔，可以做兩組平行實驗。其中每個大孔中有9個小孔?？梢苑謩e鋪不同的細胞，細胞互相分開而生長在同一個培養環境中。

1. 實驗設計

1）將共培養載玻片上其中一個大孔中的9個小孔分為三列：左邊一列鋪入 7×104 的CD34祖細胞，中間和右邊兩列均按照每孔7個HUVEC細胞團與collagen gel相混鋪入每個孔中（圖二）。

圖二：實驗設計圖示。設計成三列可以對比不同濃度梯度下由CD34細胞旁分泌的細胞因子對細胞團血管生成的影響。

1. 對照組為*列不加入任何細胞，但仍使用collagen gel作為細胞基質在剩下兩孔中加入HUVEC細胞團。
2. 低氧測試，將鋪好細胞的培養板再分為兩組，一組放入20%氧含量環境中37℃孵育30分鐘，另一組放入1%氧含量環境中37℃孵育30分鐘。
3. 在每個大孔中加入500μl內皮細胞培養基（ECGM），并繼續在相應的環境中培養24小時。
4. 以10%多聚甲醛終止實驗，并且每列至少選擇10個細胞團進行血管生成出芽方向和長度的測量和數據統計。

1. 實驗結果

1. 細胞團血管生成形態對比（圖三）：

圖三： 有CD34祖細胞存在的內皮細胞團的血管生成出芽具有方向性，而空白對照出芽沒有方向性。

1. 出芽長度對比（圖四）：

圖四：a）無CD34的存在時，低氧環境使得血管生成出芽長度有顯著的提升。B）在同樣濃度下，CD34祖細胞也會使內皮細胞團的出芽長度有顯著的提升。

1. 20%氧濃度下，與CD34細胞共培養的細胞團血管生成出芽方向結果（圖五）：

圖五：在有CD34祖細胞的存在下，離CD34細胞近的細胞團血管生成出芽展現出一個方向特異性。

4）1%氧濃度下，與CD34細胞共培養的細胞團血管生成出芽方向結果（圖六）

圖六：在低氧的環境中，內皮細胞團對CD34祖細胞同樣有方向敏感性，離CD34細胞近的細胞團血管生成出芽展現出一個方向特異性。