傷口愈合／細胞劃痕實驗新方法－如何劃出筆直均一的劃痕

更新時間：2016-03-31 更新時間：2016-03-31 點擊次數(shù)：6764次

前言

傷口愈合實驗是體外研究細胞遷移的一個有用的實驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個空白的無細胞的地帶，然后對這個無細胞地帶的邊緣的細胞進行觀察；這些邊緣的細胞會開始進行遷移活動，并且終覆蓋整個無細胞的區(qū)域，重新互相接觸在一起。

傳統(tǒng)實驗方法

細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁后，使用移液槍的槍頭在貼壁細胞的中間劃過，人為造成一道傷口（劃痕），之后定時測量劃痕的寬度，進而得到傷口愈合的細胞遷移數(shù)據(jù)。

實驗缺點：

1.手動劃痕，不能保證每次劃痕的一致；

2.有時候在劃細胞的同時會刮壞一片細胞，對劃痕的邊緣的細胞造成機械損傷；

3.如果培養(yǎng)皿底部還有包被蛋白的話，槍頭劃過，很可能傷害到包被，進而影響到細胞遷移，結(jié)果便很難判斷是哪個因素造成了決定性的影響。

4.定時測量劃痕的寬度，計算劃痕寬度隨時間推移的變化；在選取劃痕測量點時，不可避免地引入了主觀誤差（人為選取了遷移結(jié)果符合實驗預期的點）；

綜上，傳統(tǒng)的傷口愈合方法總是重復性不佳，對于實驗結(jié)果的闡述說服力不足。

下面分享一種新方法，輕松得到筆直均一的劃痕！

實驗核心

使用傷口愈合插件制造筆直均一的劃痕（圖一）。

實驗方法

為了獲得更好的實驗結(jié)果，在做實驗之前好進行一次預實驗，以確定需要使用的細胞懸液的密度。我們建議，好將細胞懸液密度調(diào)整為24小時后正好可以長滿每個插件的小孔。

圖二：A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細胞。

當所有細胞都貼壁并且剛剛長滿的時候，就可以開始傷口愈合實驗了。用鑷子將傷口愈合插件提出，之后加入新鮮的培養(yǎng)基，或者在培養(yǎng)基中加入刺激劑，然后觀察傷口愈合的情況。

圖三：用鑷子移除插件

圖四筆直均一的劃痕

一般傷口愈合實驗都是采集一張“劃痕”的初始圖像，再在實驗結(jié)束時候采集一張“劃痕”愈合的圖像。我們建議可以在這個過程多做幾個時間點，這樣可以觀測到細胞遷移隨時間的變化特征。

在顯微鏡下選取能同時看到“劃痕”和兩邊細胞的視野進行成像，“劃痕”的方向好在視野內(nèi)為水平的或者垂直的。
MCF-7細胞每半小時采集一張圖片，一直持續(xù)到20小時。
采用ibidi傷口愈合分析軟件，統(tǒng)計細胞的覆蓋面積，做出曲線圖，可以看到在大約11個小時的時候，細胞基本就已經(jīng)長滿了，接下來幾個小時細胞覆蓋面積都不會發(fā)生變化（圖五）。