µ-Slide趨化載玻片|HUVEC的3D免疫熒光染色細胞趨化實驗

　　在趨化性細胞遷移后，可通過免疫細胞化學染色研究定向細胞遷移的形態學特征。ibidi µ-Slide Chemotaxis細胞趨化載玻片可對嵌入的HUVEC（人臍靜脈內皮細胞）進行免疫熒光染色的詳細實驗方案。

µ-Slide 細胞趨化載玻片

　　一、實驗材料準備：

　　二、實驗步驟：

　　將人臍靜脈內皮細胞接種在百分之五十的Matrigel®中，并填充至細胞趨化載玻片中，然后將其沿百分之十的FCS梯度遷移二十四個小時。采用免疫染色法觀察內皮細胞在Matrigel®中定向遷移后的形態學特征。人臍靜脈內皮細胞的染色是直接在µ-Slide細胞趨化載玻片中進行的。

　　1) 從一邊儲液池中取出塞子，然后吸出培養基。在抽吸和沖洗步驟中，將塞子留在中央通道中。

　　2) 用1x PBS洗滌

　　3) 用百分之四的多聚甲醛固定細胞和基質蛋白

　　4) 重復實驗操作過程2的步驟

　　5) 用百分之零點二的riton X-100 / PBS透化細胞

　　6)  繼續重復實驗操作過程2的步驟

　　7) 用百分之一的BSA/PBS阻斷非特異性抗原→過夜

　　8) 繼續重復實驗操作過程2的步驟

　　9) 添加一抗：單克隆抗VE鈣黏著蛋白，小鼠在四攝氏度下1x 24小時

　　10) 繼續重復實驗操作過程2的步驟

　　11) 添加二抗：山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 680→在四攝氏度下過夜

　　12) 繼續重復實驗操作過程2的步驟

　　13) 加入染色混合物

　　i) 羅丹明phalloidin染色肌動蛋白絲

　　ii) Hoechst 33342對細胞核染色

　　14) 繼續重復實驗操作過程2的步驟

　　15) 將最后的PBS留在儲液罐中并開始成像。

　　免疫熒光圖像是由共聚焦激光掃描顯微鏡獲得，配以水物鏡。

　　重要提示：與標準染色方案相比，洗滌和染色步驟所需的培養時間更長。這是為了確保抗體通過凝膠充分擴散。

　　三、細胞樣品實驗結果：

　　人臍靜脈內皮細胞在Matrigel®基質中的免疫染色顯示，相鄰的細胞組優先形成細胞簇并作為集合體遷移。少數細胞呈單細胞遷移?！　?/span>

　　圖中顯示人臍靜脈內皮細胞在百分之五十的Matrigel®中的多細胞趨化性的細胞簇。固定后，對細胞進行細胞核藍色、F-肌動蛋白紅色和VE鈣粘蛋白青色等進行染色。白色箭頭表示VE介導的細胞-細胞接觸。

　　當細胞作為個體遷移時，細胞體被拉長，呈間充質梭形。細胞呈前后極性，前緣呈小片狀，向梯度方向有突起。當以多細胞單元組織時，細胞團簇表現出明顯的前后不對稱的群極化。在這里，一個或幾個前導細胞參與了前緣的形成，前緣表現出細長的突起或寬的片層。遷移復合體較深區域的連續細胞沒有極化。然而，這些細胞特征性地保留了VE鈣粘蛋白介導的細胞-細胞接觸。