ibidiµ-Slide2Well共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)描述了將斑馬魚幼蟲嵌入低百分比低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行延時(shí)顯微鏡觀察的過(guò)程。

　　2.共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備　　

　　(ibidi, 81806)

　　• 熱混合器 (例如，Eppendorf，ThermoMixer C)

　　• µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，ibiTreat底部處理 (ibidi, 81806)

　　• 塑料移液管

　　• 可選： 小刷子

　　• 顯微鏡

　　3.實(shí)驗(yàn)步驟

　　實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作：

　　在開始實(shí)驗(yàn)之前，按照“緩沖液和溶液"部分的描述準(zhǔn)備LMPA。保持在35°C，直到需要使用。如果瓊脂已經(jīng)提前準(zhǔn)備好，可以在熱混合器中重新加熱 (~80°C)，然后讓瓊脂冷卻 (~35°C)。

　　裝載：　

　　在我們小組的某些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)斑馬魚脊髓進(jìn)行了機(jī)械性損傷。如果這樣做，建議請(qǐng)?jiān)谘b載前讓幼魚恢復(fù)至少30分鐘。在脊髓橫切后，嵌入瓊脂的初始存活率為80%。這些幼魚在瓊脂中觀察48小時(shí)后也都存活了。未受傷的幼魚的初始存活率接近100%。

　　1. 使用三氯-甲-烷使用溶液麻醉斑馬魚幼魚2分鐘。

　　2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片的每個(gè)孔中放置一只幼魚，并使用一些多余的魚水。

　　3. 對(duì)每只幼魚單獨(dú)執(zhí)行以下步驟（以避免變干）：

　　3.1. 使用塑料移液管除去所有魚水。

　　3.2. 向小孔中加入50µl LMPA，以覆蓋幼魚。

　　3.3. 使用刷子或小的移液管頭將幼魚定位到適當(dāng)?shù)奈恢茫▊?cè)面位置，盡可能水平和直立，具有統(tǒng)一的對(duì)準(zhǔn)，即始終向左，卵黃在底部）。

　　4. 讓LMPA凝膠固化（0.5%凝膠約需20-30分鐘）。

　　5. 可選：用包含80mg / L三氯-甲-烷庫(kù)存溶液的1x魚水覆蓋固化的LMPA凝膠，以進(jìn)行連續(xù)成像的麻醉。

　　6. 用自帶的蓋子蓋住µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，以避免蒸發(fā)。

　　7. 斑馬魚幼魚已經(jīng)上樣好準(zhǔn)備成像

　　在48小時(shí)的成像期間，如果蓋子緊閉，則無(wú)需在瓊脂上方加入魚水，因?yàn)闃?biāo)本不會(huì)變干。這也使得可以進(jìn)行正置顯微鏡觀察，而不必?fù)?dān)心灑出來(lái)。　　

圖1：斑馬魚幼蟲嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器

　　延時(shí)顯微鏡觀察：

　　這種樣品制備方法被用于連續(xù)延時(shí)顯微鏡，以及使用德累斯頓技術(shù)大學(xué)CRTD的核心設(shè)施——光學(xué)顯微鏡設(shè)施的各種顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)拍攝某些視場(chǎng)的快照。 這包括倒置和正置，廣角和共聚焦顯微鏡。　　

圖2：A）斑馬魚幼蟲受精后72小時(shí)，埋入瓊脂3小時(shí)后的整個(gè)µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器的亮場(chǎng)瓦片掃描，共有18條幼魚